ELISA试剂操作过程中可能出现的问题和解决方法

问题

可能原因

解决方法

显色淡，灵敏度偏低

1、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高

试剂盒置保温箱内运输，并放足够数量的冰袋，尽量缩短运输时间

2、试剂盒超过有效期

超过有效期试剂盒不要使用

3、试剂、样品用前未充分平衡

用前试剂、样品从2～8℃冰箱取出后，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）

4、试剂开启时间过长长菌

试剂开启后尽请尽量在短时间内用完

5、恒温培养箱温度不足最佳反应温度（37℃）

放入酶标板时注意培养箱温度，及时调整，孵育反应期间开启不宜太多，影响温度平衡

6、孵育反应时间不足

定时钟准确定时

7、洗涤时冲击力太大、洗涤液浸泡时间过长、洗涤次数增加

减少洗涤冲击力，按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数

8、移液器吸液量不足，移液抽吸排放太狭，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁

校正移液器，吸头要配套，装吸头时要紧密，移液不宜过快，排放应完全。吸头内壁要清洁，最好一次性使用

9、蒸馏水水质有问题

使用新鲜合格的去离子水配制试剂

10、显色剂反应时间不足

准确定时(15-20 min)

11、酶标仪滤光片设定不正确，滤光片不匹配

重新按所须设置滤光片

12、样品用NaN3防腐，抑制了酶的反应

样品中不能加NaN3防腐

13、浓缩抗体稀释不正确

严格按说明说操作（现用现稀释）

背景深，全部呈有色

1、洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留

浓缩洗液准确配制；25倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释；充分洗涤，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染

2、整批样品放置时间过长，样品污染

样品应新鲜采集，或低温保存，防止污染

3、 酶加量过多

加酶前验看移液器调节量是否准确

4、培养箱温度超过37℃，酶结合物反应时间或显色剂显色时间超过时间较多

调整培养箱温度，准确定时

5、吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底而用于加酶或显色剂

吸嘴尽可能一次性使用

6、蒸馏水被污染

使用新鲜蒸馏水

7、 显色剂受光照时间较长，或污染

显色剂应于使用前20-30分钟从冰箱取出

重复性差

1、样品数量多少不一，加样时间有长有短

重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近

2、 对于定量产品，没带标准品，采用以前的标准曲线

每次实验都必须带标准品

3、 样品加入后未混匀

加样后在振荡器上充分混匀

4、孵育时间不一致，洗涤条件不一致，显色条件时间不一致，操作人员不一致

重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性

5、移液器加样量不一致

样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸头移液时用力及抽吸速度一致

6、酶标仪滤光片不对或输入波长不对

TMB显色用450或450/630nm双波长

7、酶标仪测定重复性差

校准酶标仪

8、操作过程个别孔液体外溅

稳拿稳放，防止外溅

9、不同批号试剂盒中组份混淆

不同批号试剂，不能混用

10、瓶盖相互交叉使用

不同组份瓶盖不能交叉使用

11、洗涤不正确

用洗液注满各孔，但不要溢出。甩板时酶标板面向下，垂直用力甩净废液(可多甩几次)，在干净、无尘或者少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分

12、唾液或其他杂物掉入孔内

用记号笔圈上，便于分析

13、不慎加酶或少加酶或显色剂

多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析

14、样本离心处理不全，致使检测时于反应孔内发生凝血现象或残留细胞成分干扰

血清或血浆应充分离心处理，3000rpm 6分钟以上

出现白板，阳性对照不显色

1、蒸馏水有问题

从仪器中取超纯水，测其pH值与电阻率

2、洗涤液配制有误

请按说明书所示稀释倍数配制

3、未加酶结合物而认为已加入

注意不要漏加

4、终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用

每次配制前均应看清标签标明物质

5、某一容器未洗净，残留灭活酶物质

尽可能用试剂盒内容器，另觅一定要洁净，可靠

花板

1、弱阳性样本

可加入相应标准品、阀值血清、定值血清等质控血清进行测定，判断该样本测定是否有意义

2、操作不慎

按说明书洗板、加样、洗板、显色尤为重要

3、洗板机孔堵，残留液较多，加洗液及抽吸洗液不均匀

检查洗板机，并进行调整、清洗

4、样本离心处理不全，致使检测时于反应孔内发生凝血现象或残留细胞成分干扰

血清或血浆应充分离心处理，3000rpm 6分钟以上

样本回收率低

1、添加浓度量不准确或添加浓度不合适，取样本提取液吹干的量不准确

校正移液器，根据曲线来添加最适浓度

反应板出现一片白或一片有色或临界对照OD值超出规定范围多是实验中某一环节发生问题，若逐一排除可能原因重复实验仍出现上述情况，可与另一批号试剂盒进行对照以排除试剂盒质量问题的可能性。